分离原代人角膜间质细胞

原理

材料与仪器

完整的人角膜
CMF-SaIineG 中性蛋白酶II L型胶原酶 1mg ml在DMEM F-12 GASP中 CMF-SaIineG配制的TrypLEExpress或0.25%膜蛋白酶 DMEM F-12 GASP DMEM F-12 2FB GASP:DMEM F-12 GASP含2%FBS CMF GASP
3.5cm塑料组织培养皿或6孔板 手术刀或单刃的安全刀片 细胞滤网 70μm血液尼龙过滤网 塑料刮片 “CellLifter"或“CellScraper" 弯虹膜剪 11cm(4-3 8in.) Jeweler’s镊 10cm(4in.) 角膜剪 19mm刀刃 尖头 Colibri缝线钳 0.1mm

步骤

(a)用CMF-SalineG清洗角膜3×5 min。

(b)剪除残留的巩膜，结膜和虹膜。

(c)加人2ml 1.2U中性蛋白酶II，4℃摇床摇动过夜。

(d)将加入中性蛋白酶II的角膜4℃摇30 min。

(e)用DMEM/F-12/GASP洗涤角膜。

(f)解剖显微镜下，小心去除上皮和内皮细胞。

(g)用塑料刮片轻刮基膜的上皮细胞面和内皮细胞面。显微镜下观察，以确保完-全去除这些细胞层。

(h)用新鲜培养基清洗角膜基质一次。

(i)用手术刀或安全刀片或精细手术剪将基质剪碎成2 mm左右的小块。

(j)用DMEM/F-12/GASP配制的胶原酶37℃消化3 h,直到大多数组织消失。

(k)400g离心10 min,弃上清。

(l)用DMEM/F-12/GASP重悬细胞，用70μm细胞滤网过滤消化液，并离心。

(m)重复上述清洗步骤两遍，每遍之后细胞计数。

(n)用MJM将分离出的间质细胞重悬并以1×104cm2的密度接种于塑料组织培养皿中。

(o)每3天更换一次培养基。

(P)当细胞达90%汇合时用胰蛋白酶消化传代：吸出培养基，用CMF-SalineG洗一次。加人胰蛋白酶或TrypLE至仅仅覆盖细胞，37℃，10 min。加人DMEM/F-12/2FB终止消化。细胞计数。将重悬的细胞离心，弃上清。用足量新鲜配制的MJM培养基将细胞重悬，以1×104cm2的密度接种

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