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    琼脂中克隆培养

    发布时间: 2022-12-13  点击次数: 154次

    原理

    温度高时琼脂呈液态,但在37℃ 时成凝胶状态,细胞悬浮在温暖的琼脂凝胶培养基中,待琼脂形成凝胶后进行培养,形成散在集落,很容易分离。

    材料与仪器

    Noble琼脂 Difco 胎牛血清
    两倍浓度培养基 生长培养基 无菌超纯水 无菌锥形瓶 吸管 通用容器 培养皿 水浴 三角瓶 托盘 电子细胞计数仪 本生煤气喷灯

    步骤

    1. 在培养皿底皿侧面编号或做好标记,将培养皿放在托盘中,很方便。

    2. 准备含 40 % FBS 的 2× 培养基(即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培养基配 2× 培养基,取半量所需终液量,加两倍浓度的血清),保持 37℃。

    3. 称取 1.2 g 琼脂。

    4. 分别在无菌锥形瓶和另一个无菌瓶中加 100 ml 无菌 UPW。将 1.2 g 琼脂放人锥形瓶中,盖好,煮沸 2 min 。另一种方法是,提前高温灭菌琼脂。但若已保存起来,使用时仍需煮沸溶解或微波炉融化备用。

    5. 将煮沸过的琼脂和有 UPW 的瓶放到 55°C 水浴中。

    6. 2× 培养基和 1.2 % 琼脂等量混合制备 0.6 % 琼脂底层,保持 37°C 。如果需要任何的生长因子、激素或其他添加物,应在此时添加至底层琼脂培养基(生长培养基,1×,用于细胞稀释)内。

    7. 在培养皿中加人 1 ml 0.6 % 的琼脂培养基,晃匀,确保培养基覆盖整个培养皿底。置于室温定型。

    8. 制备细胞悬液,计数。

    9. 准备 0.3% 琼脂培养基,保持 37°C 。此培养基可以用 37°C 的 2× 培养基、55°C 的 1.2 % 琼脂和 55°C 的 UPW 以 2:1:1 的比例混合制备。

    10. 制备以下稀释浓度的细胞,使细胞的最大浓度为 1×105 /ml。

    (a)1×105 /ml

    (b)将 1×105 /ml 稀释 3 倍成 3.3×104 /ml

    (c)将 3.3×104 /ml 稀释 3 倍成 1.1×104 /ml

    (d)将 1.1×104 /ml 稀释 3 倍成 3.7×103 /ml

    11. 将四种稀释液的浓度分别标在 4 个小玻璃瓶或试管上,从每种稀释液中吸出 40 μl,包括 1×105 /ml 细胞液,分别放入相应容器内 37°C 加 4 ml 0.3% 琼脂培养基,混匀,再从每个容器(通用容器,小玻璃瓶或离心管,稀释细胞用)中吸出 3 个 1 ml 分别加在相应的三个培养皿上。最终浓度如下:

    (a)1×103 /ml/皿

    (b)330 /ml/皿

    (c)110 /ml/皿

    (d)37 /ml/皿

    加细胞之前, 确保上层琼脂培养基有足够的时间冷却至 37°C 。

    12. 待培养皿中的溶液在室温下形成凝胶状态。

    13. 将培养皿放置在一个带盖的清洁塑料盒中,37°C 加湿温箱中培养 10 天。

    注意事项

    准备培养基和细胞之前,先算出细胞稀释度,在培养皿上做好标记,检测一个细胞系的克隆形成率时,为每种稀释度的细胞分别准备3 个培养皿。每个3. 5 cm 培养皿适宜接种的细胞數是1000、333、111和 37 个。也就是依次 3 倍的稀释细胞悬液。如果需要加入生长因子、激素或其他添加剂,应加在下层的 0.6 % 琼脂中。


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