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    前列腺上皮

    发布时间: 2022-12-13  点击次数: 144次

    原理

    取出前列腺和处理标本(30 min),用胶原蛋白酶消化前列腺组织(1 h),收集单个细胞和小的细胞团(1 h)。接种细胞,培养至形成单层(7 d)。

    材料与仪器

    胎牛血清或马血清 青霉素 卡那霉素 霍乱毒索 地塞米松 EGF 羊催乳激素或鼠催乳激素 胰岛素 部分精制的前列腺调理素或精制的前列腺调理素 I型胶原蛋白酶 大鼠
    生长培养液 盐性培养液
    Petri培养皿 手术剪 注射器和14-G插管 25ml Erlenmeyer烧瓶 金属丝滤网 50ml锥形塑料离心管 尼龙滤网 24孔塑料培养板 振荡水浴箱 离心机 血细胞计数板或Coulter计数器

    步骤

    1. 在无菌条件下,取出理想的前列腺叶,放入灭菌过的 60 mm Petri 培养皿(玻璃或塑料的,直径为 60 mm)。

      2. 剪除前列腺叶的脂肪,然后称重。

      3. 加入 2 ml 胶原蛋白酶(675 U/ml,用含有 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 卡那霉素的 MSS 配制)。

      4. 用手术剪将前列腺叶剪成约 1 mm 大小的组织块。组织块应小,足够通过 14-G 插管。

      5. 用注射器和 14-G 插管将组织块移于灭菌过的 25 ml Erlenmeyer 烧瓶,然后加入胶原蛋白酶,每 0.1 g 湿组织加入 1 ml。

      6. 置于振荡水浴箱,在 37°C 条件下孵育 1 h 。

      7. 分 3 次用 14-G 插管吸出消化的细胞悬液,然后用孔径为 1 mm 的金属丝滤网(孔径为1 mm,与 50 ml 锥形离心管配用)将细胞悬液滤入 50 ml 圆锥形塑料离心管,以除去碎片和未消化的组织。加入等量含有 5 % 胎牛血清或马血清的 MSS,浸洗细胞悬液。

      8. 在 4°C 条件下离心(100 g,5 min),收集细胞。

      9. 用 5 ml 含有 5 % 血清的 MSS 混悬细胞,然后依次用孔径为 250 μm 、150 μm、100 μm 和 40 μm 的尼龙滤网(与 50 ml 锥形离心管配用)过滤细胞悬液,并每次用 5 ml 含有 5 % 血清的 MSS 冲洗滤网。

      10. 通过离心收集细胞,然后用 5 ml WAJC404 培养液混悬细胞。

      11. 计数细胞,将细胞浓度调整至 4×106 个/ml。

      12. 将细胞接种于 24 孔板,每孔(面积约为 2 cm2)接种 50 μl 细胞悬液(含有 2×105 个细胞)。每孔内有 1 ml WAJC404 培养液、10 ng/ml 霍乱毒素、1 μmol/L 地塞米松、10 ng/ml EGF、1 μg/ml 催乳激素、5 μg/ml 胰岛素、10 ng/ml 前列腺调理素、100 U/m 青霉素和 100 μg/ml 链霉素。可按 McKeehan 等 [1984] 以及 Chaproniere 和 McKeehan [1986] 叙述的方法替代部分精制的前列腺调理素。

      13. 在 95 % 空气和 5 % CO2 的湿润环境和 37°C 条件下培养。第 3 天和第 5 天换液。第 7 天细胞可能接近单层。


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