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    T淋巴细胞转化实验

    发布时间: 2023-01-10  点击次数: 65次

    原理

    T 细胞在体外培养时,受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)刺激后,可出现细胞体积增大,代谢旺盛,蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平,因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。
    淋巴细胞转化试验有形态计数法、MTT 法和同位素法三种。
    MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT 是一种噻唑盐,化学名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑,水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConA 作用后发生增殖活化,其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高,MTT 作为其底物参与反应,形成蓝色的甲臜(Formazan)颗粒沉积于细胞内或细胞周围,经盐酸─异丙醇溶解后为蓝色溶液,可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD 值,测定波长570 nm。根据OD 值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。

    3H-TdR 掺入法:细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制,这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。一般来说,一个细胞周期可大致分为四期,即G1 期、S期、G2 期和M期。其中S期为DNA合成期,主要功能活动为DNA合成。3H-TdR即(甲基-3H)胸腺嘧啶核苷([3H-methyl]thymidine),是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多,则所掺入的3H-TdR就越多,因此,检测所掺入的3H-TdR就可反映细胞增殖的程度。因该方法有同位素污染问题,故我们实习中仍用MTT法。

    材料与仪器

    ICR小鼠
    RPMI1640培养液 Hank's液 刀豆蛋白A MTT 碘酒 酒精
    无菌尖吸管 刻度吸量管 无菌解剖器械 平底培养板 CO2培养箱 酶标测定仪

    步骤

    1.  小鼠脾细胞悬液的制备
    取一个灭菌的平皿,加入5 ml Hank's液。颈椎脱臼法处死小鼠,取脾脏,放入平皿中,在钢网上研磨并过筛,制成细胞悬液。取出100 μl用于计数。将其余细胞悬液移入一离心管中,离心1500 rpm,7 min,(或1000 rpm,10  min)弃去上清,用RPMI1640 培养液稀释,制成2.5×106 /ml的脾细胞悬液,然后加入ConA使每孔最终浓度为2 μg/ml,同时做不加ConA的阴性对照孔。
    2.  将上述细胞悬液加入96孔平底培养板中,每孔0.1 ml。
    3.  将培养板放入含有5 %CO2的37 ℃培养箱中培养48-72 小时,在培养结束前4-6 小时,于培养板各孔内加入1 mg/mlMTT液,10 μl/孔。37 ℃培养6 小时。
    4.  各孔内加入0.01 M 盐酸—异丙醇110 μl,30 分钟内(或加2 %SDS100 ul/孔,过夜)用酶标测定仪测OD 值,测定波长570 nm。

    注意事项

    1.  由于本实验需要培养3 天,才能观察结果。因此,在操作时应注意无菌操作,避免细菌污染,导致实验的失败。
    2.  细胞操作要轻柔、迅速,以免细胞损伤影响实验结果。





    常见问题

    一、实验结果

    将实验组和对照组三个复孔的 OD 值平均。

    转化值=实验组的平均OD 值-对照组的平均OD 值。


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