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    小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养

    发布时间: 2023-01-11  点击次数: 54次

    原理

    将小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)从机体中取出,经胰酶、螯合剂(常用EDTA)处理,分散成单细胞,置MEF生长培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖。

    材料与仪器

    孕鼠
    PBS EDTA 胰酶 MEF生长培养基 FBS 高糖DMEM
    眼科直剪 眼科直镊 眼科弯镊 玻璃平皿3 尼龙滤网 离心管 手术刀片

    步骤

    一、实验材料准备

    1.   动物
     
    孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
     
    2.   试剂
    无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
     
    3.  器械
     
    眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml和15 ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

    二、具体操作

    1.  处死孕鼠,全身置于75%酒精里浸泡,然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开,用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层,露出子宫,最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中,冲洗去血。
     
    2.  用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除,然后夹掉头和内脏,将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中,轻轻颠倒两次,倒掉D-PBS,再重复此步骤一次,注意要留少许D-PBS,然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中,并用手术刀片将其细细切碎。
     
    3.  用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体,转移至15 ml离心管中,于4℃ 1500 rpm离心5分钟,倒掉上清,以10 ml胰酶重悬沉淀,放在37℃水浴中消化30分钟,且每隔五分钟轻轻晃动,使之充分消化。
     
    4.   将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中,用200目的尼龙网过滤后,以1 500 rpm离心5分钟收集细胞,再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。
     
    5.  细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。
     
    6.   3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中,接种到200 ml培养瓶中。
     
    7.  24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。
     
    8.  细胞长满后,先用D-PBS冲洗,倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长,作者一般不超过五分钟),按1:5传代。
     
    9.  细胞再次长到覆盖率80-90%左右,将其消化后,常规冻存(冻存液要现配)。
     

    小鼠胚胎成纤维细胞(MEF 100倍)

    注意事项

    1.   原代培养,一定要避免污染。
     
    2.   MEF生存能力有限,如果不冻存,体外存活十代左右。
     
    3.  冻存后复苏的细胞只能传代一次,因为这些细胞繁殖能力有限。
     
    4.  消化细胞时间不要过长。


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