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    混合淋巴细胞增殖

    发布时间: 2023-01-11  点击次数: 73次

    简介

    混合淋巴细胞增殖实验也称混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR),常用于器-官-移-植前的组织配型,以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA 抗原)相容的程度。

    材料与仪器

    器材:细胞培养瓶、培养板、吸管等、CO2 细胞培养箱、超净台。
    试剂:
    ① 10%FCS-RPMI 1640 培养基 ;
    ② 细胞 DCs 细胞、反应细胞、外周血单个核细胞。
    ③ 3 H-TdR 工作液


    步骤

    混合淋巴细胞增殖实验的基本过程可分为如下几步:
    (一)刺激细胞(DCs)的制备
    A. 取健康志愿者肝素抗凝的外周血,淋巴细胞分离液分离单个核细胞
    B. 以 10% FCS-RPMI 1640 悬浮细胞置培养瓶中,37℃、5% CO2 培养 2 小时,轻轻翻过培养瓶,弃掉培养上清,将非贴壁细胞弃掉,即得贴壁的单核细胞
    C. 补加 10% FCS-RPMI 1640 同时加入 20 ng/ml 的 hGM-CSF,500 IU/ml 的 IL-4,培养至第 7 天,收集悬浮细胞,即为 DCs
    D. 刺激细胞经 25 μg/ml 的丝-裂-霉-素 C 或 2000 rad y-射线照射处理使刺激细胞失去增殖能力。
    (二)反应细胞的制备
    A 取健康人外周血制备单核细胞,PBS 洗 3 次后,37℃、5% CO2 贴壁 2 小时,收集悬浮细胞,作为反应细胞
    B 以 RPMI 1640 培养液重悬,调整细胞浓度至 1x106 个/ml。
    (三)混合淋巴细胞反应
    A 将刺激细胞调整浓度分别为 1x106、5x105、2x10、1x105、5x104 个/ml, 10%FCS-RPMI 1640 培养于 96 孔培养板中,每浓度设立 3 孔,100μL/孔
    B 将反应细胞浓度按 1x106 个/ml 每孔分别加入上述各孔中,100μl/孔
    C 同时设立刺激细胞对照组(不同浓度刺激细胞 100μl+培养液 100μl)和反应细胞对照组(反应细胞 100μl+培养液 100μl)
    D 37℃,5% CO2 培养 5 天后,3 H-TdR 掺入率检测反应细胞的增殖水平。


    注意事项

    1. 实验中注意无菌操作
    2. 如作单向混合淋巴细胞实验,则刺激细胞接受照射剂量要准确,使细胞暂时存活,但失去增殖的能力。


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