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    Feulgen反应显示细胞中DNA

    发布时间: 2023-01-13  点击次数: 63次

    简介

    Feulgen反应由Feulgen在1924年发明,是一种传统的、也是最为经典的通过化学染色来特异性显示细胞中DNA的方法。

    原理

    Feulgen反应显示细胞中DNA的基本原理是首先采用稀酸作用于DNA,使其脱去嘌呤碱,暴露出游离醛基,该醛基与Schiff试剂反应生成紫红色产物,细胞中存在有DNA的部位即呈现紫红色阳性反应。如图3-1中所示,碱性品红是红色物质,能与产生SO2的试剂作用形成无色产物,即Schiff试剂,它可以与DNA水解释放出的醛基结合而氧化为紫红色化合物。

    用途

    Feulgen 反应显示细胞中 DNA 既可检测细胞或组织中 DNA 的存在部位及分布,也可利用其显色强度与 DNA 含量成正比的特性,用于对细胞或组织中的 DNA 含量进行测定。由于反应对含有 DNA 的核结构显示细致、清晰,染色稳定,有利于鉴别不同核结构和分化程度的细胞,如白血病细胞等。

    材料与仪器

    器材:

    尖头镊子、染色缸、盖片、载玻片、吸管、吸水滤纸、普通光学显微镜、恒温水浴箱、CO2培养箱、HeLa人宫颈癌上皮细胞。

    试剂:
    ①Hanks液


    (1)原液甲NaCl 160 g ,KC18 g ,MgSO4•7H2O2 g ;MgCl2•6H2O2 g ,溶于800 mL  蒸馏水中。CaCl2(无水)2.8 g ,溶于100 mL 蒸馏水中。将两种液体混合后,加水至1000 mL ,用滤纸滤过,再加2 mL 氯仿防腐,置4 ℃ 冰箱备用。

    (2)原液乙 Na2HPO4•12H2O3.04 g ,KH2PO41.2 g ,葡萄糖20.0 g ,溶于800 mL 蒸馏水中,用滤纸过滤,然后加0.5%酚红80 mL ,再加水至1000 mL ,最后加入2 mL 氯仿防腐,置4 ℃ 冰箱备用。
    (3)使用液甲乙两液各1 份 ,双蒸水18 份 ,混匀分装,经101 bf /in (68.9 kPa )15 min 高压灭菌后置4 ℃ 冰箱中保存。临用前用无菌的5.6%NaHCO3 调至所需 pH 值。)
    ②1 mol /L 盐酸
    ③Schiff 试剂
    (碱性品红0.5 g 加入100 mL 煮沸的蒸馏水中,持续煮沸5 min ,并随时搅拌,使之充分溶解。然后将其冷却到50 ℃ ,过滤到棕色瓶中,加1 mol /L  HC110 mL ,冷却至25 ℃ 时加入1 g 无水亚硫酸氢钠(NaHSO3),需充分振荡后,避光过夜。次日取出(呈淡黄色),加0.25 g 活性炭剧烈振荡1 min ,过滤后即得 Schiff 试剂,此时溶液应完-全无色。避光、低温、密封保存。用前应事先取出使其恢复至室温。)
    ④ Carnoy 固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)
    ⑤0.5%亮绿
    ⑥蒸馏水
    ⑦70%乙醇
    ⑧80%乙醇

    ⑨95%乙醇


    ⑩无水乙醇
    ⑪二甲苯
    ⑫中性树胶

    步骤

    Feulgen 反应显示细胞中 DNA 的基本过程可分为如下几步:
    A.将培养的 HeLa 细胞接种于盖片,24~48 h 后生长为单层。
    B.取细胞盖片1 张 ,用 Hanks 液(pH 7.2~7.4)漂洗3 次 ,吸水滤纸吸干液体。
    C.放入 Carnoy 固定液中固定30 min 。
    D.蒸馏水洗3 次 。
    E.将盖片置于1 mol /L 盐酸中,60 ℃ 水浴水解10 min 。
    F.蒸馏水洗1 次 。
    G.将盖片移入 Schiff 试剂中,暗处反应30 min 。
    H.流水冲洗5 min 。
    I.蒸馏水洗3 次 。
    J.0.5%亮绿复染1~3 min 。
    K.70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→无水乙醇梯度脱水。
    L.盖片浸入二甲苯中透明5 min 。
    M.滴1 滴 中性树胶于载玻片上,将盖片细胞面朝下封片。
    N.镜下观察。

    注意事项

    1.本实验的关键步骤是有效地控制DNA水解的程度,包括稀酸的浓度,水解的时间、温度等。水解不足,会使游离醛基的暴露不完-全,反应变弱;水解过度,会导致 DNA 异常降解,也同样使反应变弱,染色深度下降,严重时出现阴性反应。一般的水解时间应控制在10~15 min ,同时应考虑不同标本材料的影响。
    2. Schiff 试剂的质量也是影响实验结果的重要因素,试剂暴露于空气中易被氧化而变成红色,使试剂失效。操作及保存中不宜过多暴露于空气,并应注意避光。
    3.本实验采用盖片培养细胞,因此在整个操作过程中,应注明盖片的正反面,防止破坏细胞面,尤其在进行流水冲洗步骤时,应避免水流直接接触细胞面。


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