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    一氧化氮合酶组化显示法

    发布时间: 2023-01-13  点击次数: 67次

    简介

    细胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶(nitxic oxide synthase,NOS)的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。还原型辅酶II(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,NADPH)是一氧化氮合酶的辅酶,可以将孵育液中的底物脱氢,然后将氢传递给硝基四氮唑蓝(NBT),使后者还原成蓝黑色沉淀。

    原理

    一氧化氮合酶组化显示实验的基本原理是细胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶(nitxic oxide synthase,NOS)的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。还原型辅酶II(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,NADPH)是一氧化氮合酶的辅酶,可以将孵育液中的底物脱氢,然后将氢传递给硝基四氮唑蓝(NBT),使后者还原成蓝黑色沉淀,此即 NADPH 所在部位,也可代表 NOS 的所在部位。

    材料与仪器

    器材:

    染色缸、载玻片、盖片、24孔板、毛笔、解剖器材、灌注器材、冰冻切片机、湿盒、恒温箱、冰箱、普通光学显微镜、大鼠。

    试剂:


    ①孵育液(NADPH、NBT)
    (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH),3 mg ;硝基四氮唑蓝(NBT),2.4 mg ;0.1 mol / L  PB(pH 7.4),2 mL ;1%Triton X-100(pH 7.4),1 mL );
    ②0.1 mol / L 磷酸缓冲液(PB)


    (磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O),3 g ;磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O),29 g ;加少量蒸馏水,调 pH 7.2~7.4,最后定容至1000 mL );

    ③1%Triton X-100。
    ④3%Triton X-100
    ⑤1%中性红
    ⑥梯度乙醇
    ⑦0.01 mol / L PBS
    ⑧4%多聚甲醛
    ⑨中性树胶

    步骤

    一氧化氮合酶组化显示实验的基本过程可分为如下几步:


    (一)脑组织冰冻切片


    A.将大鼠常规灌注固定,取脑组织块,浸30%蔗糖后行冰冻切片(片厚40 μm )。

    B.将切片浸入0.1 mol / L 磷酸缓冲液(0.1 mol / L PB,pH 7.2~7.4)中漂洗10 min ,重复3 次 。

    C.1%Triton X-100(用0.1 mol / L PB配制,pH7.4)中,室温,预浸60 min 。

    D.浸入孵育液中孵育,37 ℃ ,3 h 。

    E.3%Triton X-100,4 ℃ ,过夜。

    F.0.1 mol / L PB中漂洗5 min ,重复3 次 。

    G.裱片,风干。中性红复染。

    H.常规脱水、透明、封片、观察。

    (二)细胞爬片或甩片


    A.细胞爬片或甩片,0.01 mol /L PBS漂洗5 min ,重复3 次 。

    B.4%多聚甲醛固定,室温,30 min 。

    C.0.01 mol / L PBS漂洗10 min ,重复3 次 。

    D.按上述脑组织冰冻切片步骤(3)~(6)操作。

    E.中性红复染,常规脱水、透明、封片、观察。

    注意事项

    1.冰冻切片采用的是漂浮法,有利于孵育液充分进入组织。

    2.本方法属于酶组化,要选择适当的固定液和恰当的固定时间和方法,否则会影响酶的活性。

    3.此方法加 Triton X-100 可以改善着色效果,降低非特异性背景染色。但 Triton X-100 预浸时间不能超过2 h ,孵育液中 Triton X-100 浓度不能高于2%,否则影响着色效果。孵育液中后加 Triton X-100 ,防止 NBT 难溶。


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