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    一氧化氮合酶免疫组化显示实验

    发布时间: 2023-01-13  点击次数: 69次

    简介

    目前免疫组化多选用 SABC 法。

    一抗是特异性的针对检测蛋白的单克隆或多克隆抗体(本实验为兔抗大鼠 iNOS )。

     

    二抗是生物素标记的针对一抗的抗体(本实验为羊抗兔 IgG )。

     

    三抗是针对生物素的链霉亲和素-过氧化物酶复合物(streptavidin biotin complex,SABC)。

     

    这样就可以通过逐级放大的方式,以过氧化物酶标记要检测的蛋白(iNOS)。显色液为二氨基联苯胺(DAB)和双氧水(H2O2)。

     

    显色原理:过氧化物酶将 H2O2 分解,产生新态氧,使 DAB 氧化,生成棕黄色颗粒产物,可根据颜色反应来判定一氧化氮合酶的有无或多少。本方法具有灵敏性高,背景低的优点。

    原理

     一氧化氮合酶免疫组化显示实验的基本原理是一氧化氮合酶按调控条件分为组构型(cNOS)和诱生型(iNOS)。前者按细胞类型又可分为神经元组构型(nNOS)和内皮细胞组构型(eNOS)。前述的组化方法不能区分上述 NOS 的具体分型,因此可以利用针对不同类型 NOS(nNOS、eNOS、iNOS)的特异性抗体,通过免疫组化方法进行显示。

    材料与仪器

    器材:

    染色缸、载玻片、盖片、吸管、吸水滤纸、小镊子、解剖器材、灌注器材、石蜡切片机、湿盒、恒温箱、冰箱、普通光学显微镜、大鼠或培养的细胞。

    试剂:
    ①兔抗大鼠 iNOS(一抗)
    ②羊抗兔 SABC 试剂盒[10%正常山羊血清、羊抗兔 IgG(二抗)、SABC(三抗)]
    ③3%H2O2-甲醇液
    ④0.01 mol / L 磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)
    ⑤0.01 mol / L 柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)
    ⑥ DAB 显色液(DAB,6 mg ;0.05 mol / L PBS(pH 7.4),10 mL ;30%H2O2,0.01 mL 。过滤去除沉淀物。用时现配)
    ⑦双氧水
    ⑧苏木精染液
    ⑨梯度乙醇
    ⑩二甲苯
    ⑪4%多聚甲醛
    ⑫石蜡
    ⑬0.3%Triton X-100。

    步骤

    一氧化氮合酶免疫组化显示实验的基本过程可分为如下几步:

     

    (一)脑组织石蜡切片


    A.将大鼠常规灌注固定,取脑组织块,常规包蜡块。

    B.石蜡切片,片厚5 μm 。

    C.常规脱蜡入水。

    D.0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。

    E.封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2-甲醇,室温,15 min 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。

    F.抗原热修复:将切片浸入0.01 mol / L 柠檬酸盐缓冲液(pH6.0),用微波炉或电炉热处理(加热至95 ℃ 后断电,间隔5~10 min ,反复1~2 次 )。自然冷却后,在0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。

    G.封闭非特异抗原:向切片上滴加10%正常山羊血清,室温或37 ℃ ,20~30 min 。甩去多余的血清,不洗。

    H.一抗孵育:滴加适当稀释的一抗(兔抗大鼠iNOS),放入湿盒中,4 ℃ ,过夜。以  PBS 代替一抗做阴性对照。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。

    I.二抗孵育:滴加生物素化羊抗兔 IgG ,37 ℃ ,30 min 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。

    J.三抗孵育:滴加链霉亲和素-过氧化物酶复合物(SABC),37 ℃ ,30 min 。0.01 mol / L PBS中漂洗5 min ,重复3 次 。

    K.显色:用 DAB 显色液显色,显微镜下监测,适时终止。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。

    L.苏木精复染,常规脱水、透明、封片。

    (二)细胞爬片或甩片


    A.细胞爬片或甩片,0.01 mol / L PBS 漂洗5 min ,重复3 次 。

    B.4%多聚甲醛固定,室温,30 min 。0.01 mol / L PBS 漂洗5 min ,重复3 次 。

    C.封闭内源性过氧化物酶:3%H2O2-甲醇,室温,10 min 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。

    D.暴露抗原:0.3%Triton X-100,室温,10 min 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。

    E.封闭非特异抗原:滴加10%正常山羊血清,室温或37 ℃ ,20~30 min 。甩去多余的血清,不洗。

    F.一抗孵育:滴加适当稀释的一抗(兔抗大鼠iNOS),湿盒中,4 ℃ ,过夜。以不加 PBS 代替一抗做阴性对照。0.01 mol / L PBS中 漂洗5 min ,重复3 次 。

     

    G.二抗孵育:滴加生物素化羊抗兔 IgG ,37 ℃ ,1 h 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。


    H.三抗孵育:滴加链霉亲和素-过氧化物酶复合物(SABC),37 ℃ ,1 h 。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。

    I.显色:用 DAB 显色液显色,显微镜下监测,适时终止。0.01 mol / L PBS 中漂洗5 min ,重复3 次 。

    J.苏木精复染,常规脱水、透明、封片。

    注意事项

    1.一抗的质量是关系到实验结果的最关键因素,一定要选用高质量的抗体。

    2.一抗、二抗、三抗的稀释浓度、孵育时间、孵育温度是十分重要的环节。在实际操作中,应根据自身实验室的条件探索合适的制备方法。

     

    3.DAB 显色液应现用现配,最早在使用前15 min 配制。

    4.实验操作过程中防止出现干片,否则会出现假阳性。为了正确估计是否是因为操作过程造成的人工假象,设立阴性对照十分必要。

    5.细胞爬片固定时采用室温,是为了防止细胞脱落。以后每步操作都要小心,防止细胞脱落。

     

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